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預印本4天快審刊登Science:冷凍電鏡助力新冠疫苗開發!

儀器信息網 2020/02/21 16:38:32 点击 666 次
[導讀] 2月19日,已于4日前發表在預印本網站bioRxiv的成果,被快速通過同行審議發表于《Science》期刊。該成果將對開發新冠疫苗提供幫助。

儀器信息網讯 2月19日(美国时间),美国卫生总署(NIH)與美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan研究组首次利用冷凍電鏡解析新冠病毒刺突蛋白分子结构的成果在《Science》上发表,该研究已于2月15日發表在預印本網站bioRxiv,並快速通過同行審議發表于《Science》期刊。該成果將對開發新冠疫苗提供幫助。

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▊ 研究背景

此前多項研究從不同角度證實,新冠狀病毒(2019-nCoV)感染人體細胞的方式與SARS-CoV類似:利用刺突蛋白(S蛋白)ACE2受體作用来感染人体细胞,即新冠病毒的S蛋白结合人体ACE2受體。

于是,S蛋白和ACE2受體成为研究的两大关键目标,本次《Science》成果正是利用冷凍電鏡技术解析了S 蛋白三维结构;而同一天(19日)西湖大學周強團隊預印版平台bioRxiv發表成果则是利用冷凍電鏡技术解析了人ACE2受體三维结构。

什麽是S蛋白?

刺突蛋白(S蛋白)是疫苗开发、治疗性抗体和诊断方法的关键目标。根据S 蛋白的蛋白结构功能可以将其分成两个功能单位:S1和S2蛋白亚基。S1能够促进病毒结合到宿主细胞受体的能力,其含有一个重要的C端受体结合结构域(RBD),正是这个位置负责和受体结合。

什么是ACE2受體?

血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS冠状病毒(SARS-CoV)的表面受体,與S蛋白直接相互作用。 ACE2也被认为是新冠状病毒(2019-nCoV)的受体,表现为严重的呼吸综合征。ACE2主要生理作用是促进血管紧张素的成熟,在肺、心脏、肾脏和肠道广泛存在。但当病毒入侵时,ACE2就被病毒“绑架”了。

西湖大學研究團隊稱:“在SARS病毒和‘新冠病毒’侵入人體的過程中,ACE2就像是‘門把手’,病毒抓住它,從而打開了進入細胞的大門。”

▊ 研究要點

1)新冠狀病毒的S蛋白結構是疫苗應對的關鍵區域

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预融合构象中的2019-nCoV S的结构:(A)2019-nCoV S一级结构示意图,按域着色;(B)具有向上构象的单个RBD的2019-nCoV S蛋白的预融合结构的侧视图和俯视图。

2019-nCoV利用密集的S蛋白进入宿主细胞。S蛋白是一种三聚体I类融合蛋白,存在于亚稳态的预融合构象中,该构象经过剧烈的结构重排以使病毒膜與宿主细胞膜融合。当S1亚基與宿主细胞受体结合时,触发该过程。受体结合会破坏融合前三聚体的稳定性,导致S1亚基脱落,并使S2亚基转变为稳定的融合后构象。为了與宿主细胞受体接合,S1的受体结合域(RBD)经历了铰链状构象运动,该构象运动暂时隐藏或暴露了受体结合的决定因素。这两个状态分别称为“向下”构象和“向上”构象,其中向下对应于受体不可及的状态,向上对应于受体可及的状态,受体结合状态不太稳定,是抗体介入的较好目标。因此,预融合S蛋白结构的表征将提供原子水平的信息,并指导疫苗的设计和开发。

 2)2019-nCoV具有與冠状病毒科相同的触发机制

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2019-nCoV S蛋白的表达與纯化

研究组制备获得了约0.5 mg / L的重组前融合稳定Sectodomain,并通过亲和层析和尺寸排阻层析将蛋白质纯化至均质(上图)。使用这种纯化的、完全糖基化的S蛋白进行冷凍電鏡表征。

收集并处理了3207张显微照片后,获得了一个3.5 埃分辨率的非对称三聚体的三维重构图像,其中一个RBD在此构象中被观察到。通过在cryoSPARC v2中使用3D可变性功能,我们观察到RBD经历了铰链状运动时S1亚基的呼吸(见以下視頻),这可能是导致S1的局部分辨率较差(與稳定的S2亚基相比)。这种看似随机的RBD运动已在密切相关的β冠状病毒SARS-CoV和MERS-CoV以及更远相关的α冠状病毒猪流行性腹泻病毒(PEDV)的结构表征中捕获。在2019-nCoV S中对该现象的观察表明,它具有與冠状病毒科相同的触发机制,其中受体與暴露的RBD结合导致不稳定的3 RBD-up构象,并导致脱落S1和S2的重新折叠。

从侧面沿着病毒膜看2019-nCoV S三聚体

从顶部朝病毒膜方向看2019-nCoV S三聚体

因为S2亚基是一个对称的三聚体,研究者对其进行了3D优化,增加了C3的对称性,得到了一个3.2 埃分辨率的图,S2亚基的密度非常好。利用这两种图谱,构建了大部分2019-nCoV S胞外域,包括每个三聚体的66个N联糖基化位点中的44个的聚糖(见下图)。

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冷凍電鏡圖和N-聯糖基化位點:(A)经C3处理的2019-nCoV S的未锐化低温EM密度图的不对称单位显示为透明分子表面

3)2019-nCoV的S蛋白與ACE2受體亲和力高于SARS-CoV:更易人传人?

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2019-nCoV S以高亲和力结合人ACE2

最近的报道表明2019-nCoV S和SARS-CoV S具有相同的功能宿主细胞受体-血管紧张素转换酶2 (ACE2),这促使研究者通过表面等离子体共振(SPR)来量化这种相互作用的动力学。ACE2與2019-nCoV S外域结合,其亲和力约为15 nM,比ACE2與SARS-CoV S结合的亲和力高出10- 20倍(上图A)。研究者还制备了與2019-nCoV S胞外域结合的ACE2的复合物,并通过负染色电镜技术对其进行了观察,冷凍電鏡高分辨观察发现(上图B),它與SARS-CoV S和ACE2之间形成的复合物非常相似。表明2019-nCoV S对人ACE2的高亲和力可能有助于使2019-nCoV S在人與人之间传播变得明显容易,但还需要更多研究来研究这种可能性。

4)针对SARS-CoV的多克隆抗体不能與2019-nCoV结合

基于SARS-CoV和2019-nCoV之间的整体结构同源性和共同的受体,研究者测试了已发表的3种针对SARS-CoV RBD区域的多克隆抗体(S230、m396和80R),对其交叉反应性进行评估。结果显示此3种抗体在新冠病毒中完全没有结合力。表明针对SARS-CoV的多克隆抗体对于2019-nCoV不一定奏效。

▋小結

了解2019-nCoVS蛋白原子水平結構將有助于進一步的蛋白質工程研究,以改善抗原性和蛋白質表達,從而助力疫苗開發。這些結構數據也有助于評估2019-nCoV突變,該突變將隨著病毒的遺傳漂移而發生;並有助于確定這些殘基是否有表面暴露,並映射到其他冠狀病毒突變蛋白的已知抗體表位。此外,原子水平的細節將使設計和篩選具有熔合抑制潛力的小分子成爲可能。這些信息將爲精確疫苗設計和抗病毒治療的發現提供支持,從而加速醫學對策的發展。

McLellan在接受新華社記者采訪時表示,他們已將這一結構的原子坐標數據發送給全球多家實驗室,其中多數來自中國,目前已有大約25家中國實驗室要求獲取相關資料。

并表示,这一成果可帮助研究人员展开三个方面的工作。第一,展开潜在药物筛查,发现可與这种刺突蛋白结合并破坏其功能的小分子;第二,设计可以與刺突蛋白结合并抑制其功能的新型蛋白分子或抗体;第三,设计出这种刺突蛋白的变体,例如使其拥有更高表达水平或热稳定性,从而诱发更强的免疫反应,以加快疫苗开发。

附:研究中應用到的部分主要儀器設備

冷凍電鏡:配置K3相機(Gatan)的Titan KriosThermo Fisher

透射電鏡:配置Ceta 16M相机的FEI Talos TEMThermo Fisher

冷凍制樣設備:Vitrobot Mark IV(Thermo Fisher

生物大分子相互作用分析儀Biacore X100GE Healthcare

色譜柱:Superose 6 10/300(GE Healthcare

等離子清洗儀Solarus 950Gatan



 


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